Razumevanje vloge strukturnih lastnosti ternarnih kompleksov pri ciljni razgradnji proteinov: Mehanistična študija /Understanding the Role of Ternary Complex Structural Features in Targeted Protein Degradation: A Mechanistic Study

Vedno večja potreba po izboljšanih protirakavih terapijah in drugim resnim boleznim zahteva inovativne pristope, ki presegajo omejitve zaviralcevmajhnih molekul. Ciljno usmerjena razgradnja proteinov (TPD) ponuja prelomno rešitev, saj izkorišča ubikvitin–proteasomski sistem celice zaodstranjevanje škodljivih ali nereguliranih proteinov namesto, da jih zgolj inhibira. Molekule PROTAC (Proteolysis-Targeting Chimera) so se izkazalekot posebej obetavna za TPD, saj hkrati združijo ciljni protein (POI) in E3 ligazo v ternarni kompleks, ki omogoča ubikvitinacijo POI in posledičnorazgradnjo proteasoma. Ta mehanizem ima potencial razširiti proteom, ki tradicionalno ni bil primeren za zdravila, obvladati pridobljeno odpornostnazdravila in zmanjšati stranske učinke – ključne prednosti v primerjavi s tradicionalnimi strategijami inhibicije.

Kljub hitremu napredku in vedno večjemu številu PROTAC v kliničnih preskušanjih pa še vedno ostajajo temeljna vprašanja o tem, kako strukturne inkonformacijske značilnosti popolnoma sestavljenega ternarnega kompleksa omogočajo selektivno in učinkovito ubikvitinacijo. Večina trenutnihmodelov temelji na statičnih kristalnih strukturah ali poenostavljenih metodah sidranja, ki redko zajamejo celoten katalitični kompleks, vključno zUb~E2 kompleksom, ali dinamični sklop možnih stanj. Posledično ostajajo številne mehanistične podrobnosti, povezane z izbiro lizinskih ostankov,specifičnostjo reakcije in celotno učinkovitostjo razgradnje, nepojasnjene.

Za zapolnitev teh vrzeli naš projekt združuje celovit nabor računalniških in eksperimentalnih metod. Uporabili bomo najsodobnejše protokole zasidranje in izboljšane simulacije molekulske dinamike za karakterizacijo geometrije struktur ternarnega kompleksa ter identifikacijo konfiguracij,odgovornih za učinkovit prenos ubikvitina. Prav tako bomo izvedli hibridne simulacije kvantne mehanike/molekulske mehanike (QM/MM) zarazjasnitev atomističnih poti začetnega koraka ubikvitinacije POI (“priming”), pri čemer specifični lizinski ostanki POI tvorijo izopeptidne vezi zubikvitinom. Komplementarni eksperimenti ubikvitinomike bodo dopolnili računalniške napovedi in identificirale, kateri lizinski ostanki soubikvitinirani

in vitro

.

Kot študijo primera bomo preučevali serijo SMARCA2/4 razgrajevalcev z različnimi jakostmi in selektivnostmi. To nam bo omogočilo razkritistrukturne dejavnike – od dolžine vmesnika (linkerja) in geometrije, do interakcij na vezavnem mestu – ki določajo razlike v vzorcih ubikvitinacije, sčimer bomo osvetlili, kako racionalno prilagoditi PROTAC za natančno targetiranje POI. Z razumevanjem medsebojnega vpliva med strukturoternarnega kompleksa, konformacijsko fleksibilnostjo in učinkovitostjo katalize želimo vzpostaviti zanesljive povezave med strukturo in aktivnostjo,ki bodo vodile razvoj naslednje generacije terapevtikov TPD.

V sklopu tega dela bomo razvili tudi avtomatizirano računalniško platformo, ki bo združila sidranje, napredne molekulske simulacije in QM/MMmodeliranje z visokozmogljivo analizo podatkov. Platforma, ki bo na voljo kot odprtokodni vir, bo dragoceno orodje za raziskovalce, ki želijooblikovati in optimizirati PROTAC za različne tarčne proteine. Kombinacija temeljitih mehanističnih vpogledov in dostopnih računalniških orodij naj bipospešila odkrivanje zdravil, osredotočenih na TPD, in odprla nove poti za zdravljenje bolezni, ki so bile prej obravnavane kot »neozdravljive«. Svojeugotovitve bomo širili preko odprtodostopnih publikacij, predstavitev na znanstvenih konferencah in ozaveščanja širše javnosti ter tako spodbujalimultidisciplinarno sodelovanje in zagotavljali maksimalni vpliv na nastajajoče področje TPD.

The ever-growing need for improved therapies against cancer and other severe diseases calls for innovative approaches that move beyond thelimitations of small-molecule inhibitors. Targeted protein degradation (TPD) offers a transformative solution by capitalizing on the cell’s ubiquitin–proteasome system to eliminate harmful or dysregulated proteins, rather than merely inhibiting them. Proteolysis-targeting chimeras (PROTACs)have emerged as a particularly promising TPD platform, simultaneously recruiting a protein of interest (POI) and an E3 ligase into a ternary complexthat facilitates POI ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. This mechanism has the potential to broaden the druggable proteome,address acquired drug resistance, and reduce off-target effects—key advantages over traditional inhibition strategies.

Yet despite the rapid progress and the increasing number of PROTACs in clinical trials, fundamental questions about how structural andconformational features of the fully assembled ternary complex drive selective and efficient ubiquitination still remain. Most current models rely onstatic crystal structures or simplified docking, rarely capturing the complete catalytic complex—including the loaded Ub~E2 enzyme—or the dynamicensemble of states it can adopt. Consequently, many mechanistic nuances underlying substrate lysine selection, reaction specificity, and overalldegradation potency remain elusive.

To address these gaps, our project integrates a synergistic suite of computational and experimental methods. We will employ state-of-the-artdocking protocols and enhanced sampling molecular dynamics simulations to characterize the conformational landscape of the ternary complexand identify configurations responsible for productive ubiquitin transfer. We will also conduct hybrid quantum mechanics/molecular mechanics(QM/MM) simulations to elucidate the atomistic pathways of the initial POI ubiquitination step (“priming”) in which specific POI lysine residues formisopeptide bonds with ubiquitin. Complementary ubiquitinomics experiments will complement the computational predictions, pinpointing whichlysine residues are ubiquitinated

in vitro

.

As a case study, we will investigate a series of SMARCA2/4 degraders with varying potencies and selectivities. This will enable us to uncover thestructural factors—from linker length and geometry to binding-site interactions—that govern differential ubiquitination patterns, ultimately sheddinglight on how to rationally tune PROTACs for efficient POI targeting. By understanding the interplay between ternary complex structure,conformational flexibility, and catalytic efficiency, we aim to establish robust structure–activity relationships that will guide the next generation ofTPD therapeutics.

In the course of this work, we will also develop an automated computational pipeline that integrates docking, advanced molecular simulations, andQM/MM modeling with high-throughput data analysis. Released as an open-source platform, this pipeline will serve as a valuable communityresource for researchers seeking to design and optimize PROTACs against diverse protein targets. The combination of thorough mechanisticinsights and accessible computational tools is expected to accelerate TPD-focused drug discovery, ultimately advancing new avenues for treatingdiseases previously considered “undruggable.” We will disseminate our findings through open-access publications, presentations at scientificconferences, and outreach to the broader public, fostering collaboration across disciplines and ensuring maximal impact on the emerging field ofTPD.